美國約翰·霍普金斯大學(xué)Ludwig中心聯(lián)合主任Kenneth Kinzler與同事Bert Vogelstein一起首先提出了“數(shù)字PCR”的概念，二人表示研發(fā)這一方法是為了更好地鑒定稀有的癌突變�！澳隳艿玫降淖铎`敏的(檢測(cè))是來源于對(duì)單分子的觀測(cè)，我們的點(diǎn)子正是來源于此�！盞inzler解釋說，“當(dāng)你從單分子開始時(shí)，(反應(yīng))要么是100%的突變，要么是100%的野生型，這使得從野生型中區(qū)分出腫瘤變得更加容易�！�
當(dāng)然，僅僅使用標(biāo)準(zhǔn)PCR也能找到非常稀有的變異事件。畢竟PCR擅長從分子的大海中撈針。理論上，在正確的引物和循環(huán)條件下，PCR反應(yīng)能夠?qū)⒁粋�(gè)分子的模板DNA復(fù)制成數(shù)百萬的子代雙螺旋，足以克隆、測(cè)序或者進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)。但這一過程不是定量的，研究者無法用最終反應(yīng)中的分子數(shù)目來推斷起始樣品中的DNA含量。
實(shí)時(shí)定量PCR通過在運(yùn)行中量化反應(yīng)解決了這一問題。例如，通過繪制隨時(shí)間變化的熒光強(qiáng)度曲線，研究人員能夠比較不同樣品間給定基因的相對(duì)表達(dá)量。然而實(shí)時(shí)定量PCR的絕對(duì)定量并不夠直接。它一般需要標(biāo)準(zhǔn)曲線來將含量轉(zhuǎn)化為絕對(duì)的濃度，而且這些濃度經(jīng)常會(huì)每天或在各實(shí)驗(yàn)室間產(chǎn)生變化。實(shí)時(shí)定量PCR也難以檢測(cè)那些微小的拷貝數(shù)目變化，例如區(qū)分6個(gè)和7個(gè)拷貝，它的靈敏度有限。
美國密歇根大學(xué)副教授、Fred Hutchinson癌癥研究中心(FHCRC)前成員Muneesh Tewari說，這種不確定性結(jié)果會(huì)比較復(fù)雜，就如數(shù)據(jù)分享，因?yàn)樵诮⒍鄼C(jī)構(gòu)實(shí)驗(yàn)時(shí)，這是一大關(guān)鍵限制。他利用數(shù)字PCR進(jìn)行小RNA生物標(biāo)記的開發(fā)�！皩�(shí)時(shí)PCR不能保持每日的精確性，有時(shí)甚至難以確保一天之內(nèi)的精確性。”他說。
數(shù)字PCR通過“逐個(gè)擊破”的策略繞開了這一問題。分子混合物被離散或分隔化到大量的反應(yīng)室中(越多越好)，這樣每個(gè)室中平均有一個(gè)或零個(gè)目標(biāo)核苷酸。對(duì)每個(gè)區(qū)劃進(jìn)行PCR反應(yīng)后，使用泊松統(tǒng)計(jì)將陽性信號(hào)的計(jì)數(shù)轉(zhuǎn)換為一個(gè)絕對(duì)值。
Kinzler將這一過程比作桑格測(cè)序。在單個(gè)管中對(duì)100個(gè)模板分子的混合物(其中有一個(gè)是突變的)進(jìn)行測(cè)序會(huì)產(chǎn)生一個(gè)電泳圖譜，其中在突變位點(diǎn)上的顯著信號(hào)會(huì)是野生型堿基。“你甚至基本不會(huì)發(fā)現(xiàn)，在(信號(hào)峰)下存在著一個(gè)表示不同堿基讀取的小突起，因?yàn)樗谡麄�(gè)分子混合物中的占比太低了�！钡珜⑦@些分子稀釋并將其分布在多重反應(yīng)中，就能產(chǎn)生出99個(gè)野生型信號(hào)和一個(gè)明顯的突變信號(hào)，這就是數(shù)字的、絕對(duì)定量的結(jié)果。
數(shù)字PCR本質(zhì)上是把弱信號(hào)從噪音信號(hào)中“拎”出來，研究人員目前已在各方面采用這一策略，從檢查拷貝數(shù)目變化和散布腫瘤DNA，到艾滋病毒載量檢測(cè)和胎兒染色體異常檢測(cè)。尤其是臨床應(yīng)用，將最有可能從這一技術(shù)中獲益(假設(shè)這種技術(shù)的簡(jiǎn)易程度適合臨床實(shí)驗(yàn)室的工作流程)。
原始的數(shù)字PCR
Kinzler和Vogelstein的原始“數(shù)字PCR”方法發(fā)表于1999年，是一項(xiàng)單調(diào)乏味，需要手工操作的辦法。他們想要檢測(cè)和量化直腸癌患者糞便樣品中的K-RAS突變，因此將基因組DNA稀釋并等分至384孔微量滴定板的各個(gè)孔中，這樣整個(gè)板就代表了單個(gè)樣品。他們隨后擴(kuò)增了包含所尋找的突變熱點(diǎn)的基因區(qū)域。
一旦反應(yīng)完成，(數(shù)字PCR基本上是個(gè)終端PCR分析，雖然不必如此)，他們將兩種熒光探針進(jìn)行雜交，一種作為對(duì)照應(yīng)該一直雜交，第二種是僅能與野生型序列結(jié)合，并讀取結(jié)果。僅有超過100個(gè)孔具有基因組DNA，其中有四個(gè)顯示出突變。
Kinzler說，這一結(jié)果表明數(shù)字PCR是“一種非常強(qiáng)大、可信和準(zhǔn)確的”稀有突變檢測(cè)方法。但它也是勞動(dòng)密集型的技術(shù)，難以擴(kuò)大。“說服一個(gè)研究生去做這個(gè)實(shí)驗(yàn)往往是不可能的�！彼f。
2003年，Kinzler和Vogelstein設(shè)計(jì)了一個(gè)稱之為“BEAMing”進(jìn)階版步驟，它依賴于“珠子、乳化、擴(kuò)增和磁力吸附”。BEAMing替代了手工在微孔板中進(jìn)行樣品離散，將每個(gè)油包水乳化的小滴變成了反應(yīng)容器。通過使用目前廣泛用于下一代DNA測(cè)序文庫制備中的乳化PCR過程，BEAMing將模板、引物、PCR試劑和磁珠的混合物分至小滴中，其中大多數(shù)的小滴不含有或只含有一個(gè)模板。PCR完成后，其中擴(kuò)增產(chǎn)物會(huì)通過生物素——鏈酶親和素的鍵合關(guān)聯(lián)在磁珠上，乳化物隨之會(huì)被打散，珠子就能通過與檢測(cè)寡核苷酸和流式細(xì)胞儀的雜交物所讀取。
BEAMing取代了在孔板上的手工操作，“能夠處理相當(dāng)于十萬個(gè)孔”，Kinzler說，他仍然在使用這一技術(shù)，并(與Vogelstein和其他同事一起)成立了Inostics公司對(duì)其進(jìn)行商業(yè)化。(Inostics隨后被Sysmex公司收購，現(xiàn)在Kinzler并不持有該公司的股份。)
基于液滴的策略也被Bio-Rad實(shí)驗(yàn)室和RainDance科技公司進(jìn)行了商業(yè)化。不同于磁珠，這兩家公司都將PCR混合物離散(又或是如RainDance的董事長和首席執(zhí)行官S. Roopom Banerjee所說的“液滴化”)成了2萬個(gè)納升大小(Bio-Rad公司的QX200)或者1千萬個(gè)皮升大小的(RainDance公司的RainDrop)液滴。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，反應(yīng)結(jié)果就可以通過熒光散射源和檢測(cè)器來讀取液滴，就像除去細(xì)胞之外的流式細(xì)胞儀。
Banerjee說：“將它想象成一臺(tái)數(shù)碼相機(jī)”。他說RainDance公司的RainDrop系統(tǒng)是一鍵式的設(shè)計(jì)，“Apple式的簡(jiǎn)單。你有一張具有多色彩和多層次的復(fù)雜相片。我們所做的基本就是將相片像素化成最小尺寸的像素，然后真的讀出每個(gè)像素以準(zhǔn)確說出那張生物相片中的內(nèi)容�！痹赗ainDance公司的案例中，需要用到4個(gè)小時(shí)來讀取8千萬個(gè)這樣的“像素”，即8個(gè)平行數(shù)字PCR反應(yīng)的輸出量。
超強(qiáng)的泊松統(tǒng)計(jì)
由于dPCR是一種終端分析法，如果目標(biāo)分子沒有很好的離散化，如一些小室在結(jié)束時(shí)具有不止一個(gè)的靶標(biāo)，那么理論上結(jié)果得到的濃度可能就會(huì)棄之不用。這就是泊松統(tǒng)計(jì)發(fā)揮作用的地方。據(jù)Bio-Rad實(shí)驗(yàn)室數(shù)字生物學(xué)中心科學(xué)事務(wù)部主任George Karlin-Neumann稱，泊松統(tǒng)計(jì)描述了一種隨機(jī)分布。只要小室沒有達(dá)到飽和，用戶就可以反算他們起始的分子數(shù)，即使一些孔中實(shí)際上容納了不止一個(gè)分子(這種情況在數(shù)字PCR中讀做單一計(jì)數(shù))�！澳愀嬖V我你有多少小室或者多少液滴，(并且)它們中多大比例呈陰性。它就會(huì)基本上告訴我初始的濃度，這也將告訴我陽性小室與陰性小室的比例�！彼f。
勞倫斯利弗莫爾國家實(shí)驗(yàn)室醫(yī)療診斷項(xiàng)目負(fù)責(zé)人Reginald Beer在研究生時(shí)發(fā)表了第一篇在單分散性(也就是說大小一致)液滴中進(jìn)行數(shù)字PCR的報(bào)道。他說基于液滴方法的優(yōu)勢(shì)在于其可擴(kuò)大性：增加反應(yīng)容器的數(shù)量相對(duì)來說很簡(jiǎn)單，這樣數(shù)據(jù)的質(zhì)量也就隨之增大�！爱�(dāng)你擴(kuò)大或增加了反應(yīng)容器的數(shù)量時(shí)，泊松精度也就大大提升了�！彼忉尩�。
這篇報(bào)告的發(fā)表建立了Bio-Rad和RainDance的數(shù)字PCR平臺(tái)的效能，以及數(shù)字PCR可擴(kuò)展應(yīng)用的多樣性。例如，RainDance公司的平臺(tái)已用于檢測(cè)神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的腦脊髓液中突變基因的轉(zhuǎn)錄本，和來源于直腸癌患者血清中的KRAS突變。
FHCRC成員Jason Bielas使用Bio-Rad的系統(tǒng)去定量分析卵巢癌中腫瘤滲透的淋巴細(xì)胞，而美國華盛頓大學(xué)實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)系病毒學(xué)主任與教授、FHCRC成員Keith Jerome則用其研發(fā)了一種方法，使其能夠區(qū)分活性HHV-6病毒血癥和整合基因組的潛在病毒。(如果發(fā)生在骨髓移植的過程中，必須處理前者而非后者;二者通過病毒序列拷貝數(shù)與血液中對(duì)應(yīng)基因組的比例進(jìn)行區(qū)分，在基因組整合的情況下應(yīng)為1.0。)
Bielas表示，他的團(tuán)隊(duì)能夠使用他們自創(chuàng)的QuanTILfy方法，能夠可重復(fù)地分解甚至是10000個(gè)癌細(xì)胞中的1個(gè)T淋巴細(xì)胞(足以檢測(cè)T細(xì)胞腫瘤擴(kuò)散與患者存活之間的聯(lián)系)。這種方法與當(dāng)前標(biāo)準(zhǔn)的免疫組化方法相比更加量化，他解釋道：“本質(zhì)上，你是對(duì)T細(xì)胞基因組進(jìn)行計(jì)數(shù)�！�
斯坦福基因組技術(shù)中心高級(jí)副主任Hanlee Ji也在使用Bio-Rad系統(tǒng)來驗(yàn)證基因組測(cè)序研究中的遺傳偏差，近期也用于在測(cè)序前對(duì)下一代測(cè)序文庫的對(duì)照樣品進(jìn)行定量。對(duì)他的團(tuán)隊(duì)來說，數(shù)字PCR的優(yōu)勢(shì)在于其簡(jiǎn)易性：他可以在幾周內(nèi)讓一個(gè)本科生在實(shí)驗(yàn)室中學(xué)會(huì)操作數(shù)字PCR，而實(shí)時(shí)定量PCR花費(fèi)的時(shí)間則會(huì)長很多。
“我對(duì)技術(shù)的一項(xiàng)測(cè)試是：如果我讓一個(gè)具有實(shí)驗(yàn)技能的本科生坐在一臺(tái)儀器面前，他們能否在幾周的時(shí)間內(nèi)按要求從陽性和陰性對(duì)照中得到正確的結(jié)果?如果可以，就說明這個(gè)系統(tǒng)很好用�！�
數(shù)字PCR與測(cè)序
2011年，Kinzler和Vogelstein提出了另一項(xiàng)用于稀有等位基因檢測(cè)的數(shù)字PCR方法，這一次是基于測(cè)序。這項(xiàng)安全測(cè)序系統(tǒng)(Safe-SeqS)的策略需要將每個(gè)模板分子標(biāo)記獨(dú)特的標(biāo)示物(或者條形碼)，然后進(jìn)行擴(kuò)增并由下一代DNA測(cè)序進(jìn)行讀取。
約翰·霍普金斯Ludwig中心轉(zhuǎn)化遺傳學(xué)部主任、約翰·霍普金斯醫(yī)學(xué)研究所腫瘤學(xué)教授Nickolas Papadopoulos是該研究的共同作者。他認(rèn)為，比起B(yǎng)EAMing來，Safe-SeqS能讓研究者將數(shù)字PCR的能力擴(kuò)展到更多位點(diǎn)——達(dá)到30個(gè)甚至以上。
“大規(guī)模平行測(cè)序代表了一種極其強(qiáng)大的數(shù)字PCR形式，億萬個(gè)模板分子能夠得到逐個(gè)分析�！盤apadopoulos及其共同作者在2011年的研究中解釋道�！八膬�(yōu)勢(shì)超過了傳統(tǒng)的數(shù)字PCR方法，其中多重堿基可以得到依次、簡(jiǎn)便的自動(dòng)化檢測(cè)�！钡怯捎跀U(kuò)增、測(cè)序和檢測(cè)中的錯(cuò)誤，下一代測(cè)序技術(shù)的固有誤差率高得讓人難以接受。通過在每個(gè)起始分子上的獨(dú)特標(biāo)示物，Safe-SeqS可以使研究者區(qū)分真正的突變和程序化的人為錯(cuò)誤。
在最初的研究中，作者評(píng)估了10萬個(gè)正常人細(xì)胞中CTNNB1基因的突變。原始Illumina測(cè)序讀取的錯(cuò)誤率為2.1×10-4。Safe-SeqS條碼標(biāo)簽可以將這一比率降低24倍，達(dá)到9×10-6。在用于線粒體DNA時(shí)，Safe-SeqS能將觀測(cè)錯(cuò)誤率降低15倍。
過去的一年中，該團(tuán)隊(duì)將Safe-SeqS擴(kuò)展到在常規(guī)巴氏試驗(yàn)的刮宮材料中尋找卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌和宮頸癌的多重信號(hào)，這是研發(fā)婦科腫瘤早期檢測(cè)系統(tǒng)的第一步。在這個(gè)例子中，該團(tuán)隊(duì)使用這一分析方法從12個(gè)癌癥相關(guān)基因中評(píng)估了46個(gè)基因區(qū)域的突變。
近期在美國圣地亞哥舉行的數(shù)字生物學(xué)會(huì)議上，Papadopoulos討論了這一方法。他說，Safe-SeqS可能會(huì)對(duì)血漿的腫瘤早期檢測(cè)十分有用�？傮w上，他的團(tuán)隊(duì)能夠在超過80%的腫瘤血漿樣品中檢測(cè)到突變。但是一些腫瘤型的表現(xiàn)比其它的要好。他說，尤其困難的是腦部的惡性腫瘤，“目前，我們僅能從10%的具有這種腫瘤型的患者血漿中檢測(cè)出突變”。
基于陣列的策略
對(duì)于美國羅格斯大學(xué)動(dòng)物科學(xué)院助理教授Andrzej Pietrzykowski來說，數(shù)字PCR的精確性對(duì)他尤其有益，他研究酒精成癮的分子和遺傳基礎(chǔ)。他看到的很多變化都小于2倍，難以被實(shí)時(shí)定量PCR所識(shí)別。他說，這一差別已經(jīng)可以在數(shù)字化中檢測(cè)到。
Pietrzykowski也提到了另一項(xiàng)優(yōu)點(diǎn)。他鑒定的一個(gè)特定小RNA可能與酒精成癮相關(guān)，而且能夠使用實(shí)時(shí)定量PCR來量化這一分子。但用實(shí)時(shí)定量PCR分析方法對(duì)于小RNA的前體來說卻難以完成，因?yàn)榻o標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)定確定可靠的對(duì)照是有問題的�！澳阈枰���兩次或三次檢查那些不隨環(huán)境變化的看家基因。”這對(duì)于數(shù)字PCR來說不是問題，因?yàn)檫@項(xiàng)技術(shù)不需要標(biāo)準(zhǔn)曲線。
Pietrzykowski是生命技術(shù)公司數(shù)字PCR應(yīng)用基金項(xiàng)目中五大創(chuàng)新基金獲得者之一，就在2013年末，他獲得了該公司的QuantStudio 3-D芯片讀取器、芯片上樣器和熱循環(huán)儀。QuantStudio 3D數(shù)字PCR系統(tǒng)就像Kinzler原始數(shù)字PCR的大馬力升級(jí)版。研究者使用了一種近似于擋風(fēng)玻璃“橡膠滾軸”的工具將樣品離散在2萬個(gè)蝕刻在硅片表面的小孔中。Fluidigm公司也使用這一物理矩陣的策略，他們的qdPCR 37K系統(tǒng)“整合流動(dòng)回路”提升了該公司的微流控專長，可將48個(gè)樣品逐個(gè)分布在770個(gè)小室中(盡管每個(gè)樣品能夠分散在多組小室中提高正確率，達(dá)37000個(gè))。
對(duì)于越來越多的特定(常常是臨床)應(yīng)用而言，這一技術(shù)明顯具有諸多優(yōu)勢(shì)。但先不要拋棄你的實(shí)時(shí)定量熱循環(huán)儀。對(duì)于大部分研究者來說，數(shù)字PCR可以是實(shí)時(shí)定量PCR的補(bǔ)充，而不是替代。的確，Beer說，對(duì)于許多應(yīng)用而言實(shí)時(shí)定量PCR“目前足矣”，而且，這一技術(shù)更加成熟并且方法也建立起來了。“從通量的角度來看，實(shí)時(shí)定量PCR仍具有顯著優(yōu)勢(shì)�！鄙夹g(shù)公司(近期被賽默飛世爾科技公司收購)數(shù)字PCR高級(jí)產(chǎn)品經(jīng)理Iain Russell表示，“坦率地講，它可以滿足市面上大量應(yīng)用的客戶需求。”
“這確實(shí)取決于你提出的問題。”Pietrzykowski說。
